等电聚焦电泳色谱仪是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的和线性的pH梯度中进行分离，等电聚焦电泳的关键是pH梯度的建立。

一、人工建立pH梯度：

在电场下利用不同pH值缓冲液相互扩散，在混合区间形成pH梯度。此pH梯度易受缓冲液离子的迁移和扩散而变动，重复性差，已不被采用。

二、利用温度梯度建立pH梯度：

因为温度可影响缓冲液的解离度，使pH值改变。由于每差别一个pH单位，温度约差50℃，故这种方法只能建立范围很窄的pH梯度，而且不易稳定。

三、加入附加物建立pH梯度：

把一些有机溶剂如乙醇和甘油等加到缓冲液中，利用附加物介电常数的变化来改变缓冲液一些组分的解离常数，可建立1.5pH单位的pH梯度。如在硼酸盐溶液中加0～5%甘油和0～3%蔗糖，可建立pH =7～8.6的梯度，可分离血红蛋白。

四、利用载体两性电解质建立pH梯度：

在电极间放入含多种不同等电点电解质的溶液，通电后在电极间形成pH梯度。这些两性电解质大多是一些多胺基多羧酸化合物。为防止对流对pH梯度的干扰，可采用加入不同浓度的中性或惰性物质形成密度梯度的方法，也可采用在电极间加入凝胶的方法。

五、利用固定化两性载体建立pH梯度：

把具有缓冲能力的基团或化合物用共聚或接枝的方法固定在载体上形成两性载体。载体是聚丙烯酞胺凝胶和葡聚糖凝胶等，被固定的化合物是带羧基的酸和带叔胺基的碱。采用这种方法可形成稳定的pH梯度，但成本太高。

六、固定化两性载体和载体两性电解质相结合：

在固相pH梯度凝胶中加入载体两性电解质作为添加剂。

七、利用离子交换剂建立pH梯度：

利用离子交换剂建立一个有pH梯度的柱进行等电聚焦。

八、由外循环建立pH梯度：

溶液在两电极室内进行循环，以在电泳分离室中建立一个稳定的pH梯度。