聚丙烯酰胺等电聚焦电泳色谱仪是利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质（一种含有各种连续pI的小分子混合物）的电泳分离技术。载体两性电解质是一系列多氨基多羧基的混合物，pI = 3～11。在制备聚丙烯酰胺凝胶时，将其混溶其中。

在没有电场时，载体两性电解质的pH值是该溶液pH范围的平均值，所有载体两性电解质分子都荷电。

当引入电场时，载体两性电解质分子向阴极或阳极迁移，带有较低等电点的分子（荷较多负电）较快地向阳极移动，当它达到净电荷为零的位置时才停止。这个位置靠近阳极，由于它具有高的缓冲能力，使环境溶液的pH等于分子本身的pI。一些低pI的载体两性电解质（荷其次多的负电）也向阳极移动，直到它的净电荷减少到零时才停止。同样，其周围环境溶液的pH值也等于它本身的pI。依次类推，所有载体两性电解质分子将分别在阳极和阴极之间到达它们自己的位置，从而形成pH梯度。

载体两性电解质在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时不再泳动，被浓缩成狭窄的区带。