不连续凝胶电泳色谱仪分析的不连续性表现在凝胶层、缓冲液离子组成、缓冲液pH和电位梯度的不连续。
一、凝胶层的不连续性：
1、样品胶：为大孔胶，采用光聚合法制备。样品预先加在其中，起防止对流的作用，避免样品跑到上面的缓冲液中。目前电泳一般不制作此胶。
2、浓缩胶：为大孔胶，采用光聚合法制备。起防止对流的作用，样品在其中浓缩，并按其迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面处浓缩成薄层。
3、分离胶：为小孔胶，采用化学聚合法制备。样品在其中进行电泳和分子筛分离，起防止对流的作用。蛋白质分子在大孔凝胶中受到的阻力小，移动速度快。进入小孔凝胶时受到的阻力大，移动速度减慢。由于凝胶层的不连续性，在浓缩胶与分离胶的界面处使样品浓缩，区带变窄。
二、缓冲液离子组成的不连续性：
在电场中如有两种电荷符号相同的离子向同一方向移动，其迁移率不同，两种离子若能形成界面，则跑在前面的离子称为快离子（前导离子），跑在后面的离子称为慢离子（尾随离子）。为了使样品达到浓缩的目的，需在缓冲液中加入有效迁移率不同的两种离子，并使这两种离子在缓冲液中组成不连续的两相，即在三层凝胶中加入快离子，在电极缓冲液中加入慢离子。为了保持溶液的电中性和一定的pH值，需加入一种与快、慢离子电荷符号相反的离子，称为缓冲配对离子，使缓冲配对离子分布于全部缓冲液中，即三层凝胶缓冲液和电极缓冲液中。
如分离蛋白质时，通常采用氯离子（Clˉ）为快离子，甘氨酸根离子（(NH2CH2COOˉ）为慢离子，三羟甲基氨基甲烷（Tris+）为缓冲配对离子。
电泳开始前，慢离子位于两个电极槽中，快离子分布于三层凝胶中，样品在样品胶中，缓冲配对离子分布于全部缓冲液中。电泳进行时，快离子与慢离子的界面向下移动。由于选择适当的pH值缓冲液，使蛋白质的有效迁移率介于快、慢离子之间，而浓缩成为极窄的区带。当样品到达浓缩胶与分离胶的界面处时，离子界面继续前进，蛋白质被留在后面，然后被分成多个区带。
三、缓冲液pH的不连续性：
在浓缩胶与分离胶之间有pH的不连续性是为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率，要求在样品胶和浓缩胶中，慢离子比所有被分离样品的有效迁移率都低，使样品夹在快离子与慢离子的界面之间被浓缩。而在分离胶中，慢离子的有效迁移率比所有被分离样品的有效迁移率都高，使样品不再受离子界面的影响。
电极缓冲液pH = 8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小。浓缩胶中的氯离子完整电离，有效迁移率大。蛋白质在浓缩胶中介于快、慢离子之间。电泳开始后，氯离子跑得较快，留下一低电导区，产生高电位梯度，使甘氨酸根离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间被压缩。
四、电位梯度的不连续性：
在不连续体系中，电位梯度的差异是自然形成的。电泳开始后，由于快离子的迁移率较大，会很快超过蛋白质，在快离子的后边形成一个离子浓度低的区域即低电导区。由于电导与电位梯度成反比，低电导区的电位梯度较高。高电位梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。当快离子、慢离子和蛋白质的有效迁移率与电位梯度的乘积分别相等时，则三种离子的移动速度相同。快、慢离子的移动速度相等的稳定状态建立后，在快、慢离子之间形成一个稳定而又不断向正极移动的界面，即在高、低电位梯度区之间形成一个迅速移动的界面，由于蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，因此就聚焦在这个移动的界面附近，被浓缩成一个狭小的中间层。
