反相键合相液相色谱仪又称非极性键合相液相色谱仪，在高效液相色谱仪中占有重要地位。
一、分离机理：
有疏溶剂理论和双保留机理。
1、疏溶剂理论：
疏溶剂理论认为非极性烷基键合相是在硅胶表面蒙覆了一层以Si－C键化学键合的十八烷基（或其它烃基）的分子毛。溶质分子（分析物）有非极性部分和极性官能团部分组成。当溶质分子的非极性部分与极性溶剂接触时，相互间产生斥力，此现象称为疏溶剂。当溶质分子的极性部分与极性溶剂接触时，相互间具有亲和力。当键合相表面的烷基（分子毛）与极性溶剂接触时，相互间产生斥力。而当溶质分子的非极性部分与键合相表面的烷基（分子毛）接触时，则相互间产生缔合作用。这种缔合作用是可逆的，缔合作用的强弱决定溶质分子色谱保留的强弱。
影响溶质保留值的因素：
（1）溶质分子结构：
在一定的洗脱液和温度下，溶质分子的logk与溶质分子中的非极性部分的总表面成正比。
溶质分子中非极性部分相同，增加极性基团，因为增加了溶质分子与洗脱液的极性分子间的作用力而使k减小。
（2）烷基键合相特性：
烷基数量越多，溶质保留越强。
烷基碳链越长，溶质保留越强。
随着烷基碳链的增长，增加了键合相的非极性作用的表面积，其影响溶质的保留值和色谱柱的选择性（即随烷基碳链的增长，其对溶质分离的选择性增大）。
（3）流动相性质：
流动相的表面张力越大，解缔合时释放的能量越多，k越大。
流动相极性越大，表面张力越小，k越小。
（4）温度：
温度升高，保留值降低，柱效提高。
2、双保留机理：
双保留机理包括疏溶剂效应和亲硅醇基效应。
亲硅醇基效应认为烷基键合相表面往往有残余硅醇基，这是一种微量酸性基团，可与溶质阳离子或氢键基团相互作用，主要影响含氮类药物的分离，造成色谱峰拖尾，柱效下降。
可加入扫尾剂降低硅胶的吸附作用，常用的扫尾剂为有机碱类，如三乙胺等。
二、键合固定相：
键合固定相是在硅胶表面键合了非极性有机基团（烃基硅烷）的固定相。
常见的烃基有丙基、己基、辛基、十六烷基、十八烷基和苯基。其中以十八烷基键合相（ODS或C18）应用较广泛。
三、流动相：
溶剂极性越低，洗脱能力越强。
1、常用流动相：
（1）甲醇－水。
（2）乙腈－水。
（3）四氢呋喃－水。
溶剂强度为水＜甲醇＜乙腈＜四氢呋喃。
系统（2）较系统（1）好，原因如下：
系统（2）的粘度较系统（1）小，柱效好。粘度降低，柱压降低，传质阻力降低（溶质扩散阻力降低），柱效升高。
乙腈的紫外末端吸收较甲醇小，在低波长处测定时，基线波动较甲醇小，测定误差小。
2、流动相的选择：
（1）二元溶剂系统：
一般以洗脱能力较弱的水作为底剂，再加入一定量的可与水互溶的有机极性调节剂。常用的专业极性调节剂为甲醇和乙腈。
（2）多元溶剂系统：
在二元溶剂系统中加入少量的四氢呋喃，常能改善某些难分离的物质对的分离度。
用水、甲醇、乙腈和四氢呋喃组成三元或四元溶剂系统，并进行优化，选出优质溶剂系统。
3、溶质保留值随溶剂极性变化的一般规律：
有机溶剂比例减小：
（1）溶剂的极性增加，洗脱能力降低，溶质的保留时间增加。
（2）不同溶质组分间的分离度增加。
（3）溶质的柱效降低。
