影响高效液相吸附柱色谱仪分离效果的主要因素有固定相的选择、洗脱剂的选择和被分离组分的性质等。
一、固定相的选择。
二、洗脱剂的选择：
在高效液相吸附柱色谱中，用于冲洗加有样品色谱柱的溶剂（单一溶剂或混合溶剂）习惯上称为洗脱剂。洗脱剂的选择，对组分分离关系极大。
溶剂的洗脱能力，主要取决于溶剂的极性。溶剂的极性可根据其介电常数作大致判断。洗脱剂的洗脱能力还与被分离物质的极性和所选用的固定相性质有密切关系。
溶剂的介电常数大小顺序：水＞甲醇＞乙醇＞丙酮＞乙酸乙酯＞三氯甲烷＞二氯甲烷＞苯＞四氯化碳＞环己烷＞正庚烷＞正己烷（石油醚）。
常用溶剂的介电常数：己烷ε为1.88，苯ε为2.29，氯仿ε为5.20，乙酸乙酯ε为6.11，乙醇ε为26，甲醇ε为31.2，水ε为81。
为了寻找合适的洗脱剂，应先作薄层或纸色谱试验，找到合适的溶剂系统后，再应用到高效液相吸附柱色谱中。如单一溶剂洗脱效果不好，可用混合溶剂，对成分复杂的混合物可用梯度洗脱。
三、被分离组分的性质：
被分离物质、固定相和洗脱剂三个要素彼此紧密相连，在指定的固定相与洗脱剂的条件下，各组分的分离情况直接与被分离物质的结构与性质有关。
常见官能团极性强弱顺序为：R－COOH＞Ar－OH＞H－OH＞R－OH＞R－NH2＞R－SH＞R－CHO＞R－CO－R＞R－COOR′＞R－N（CH3）2 ＞R－NO2＞ROCH3＞－CH = CH－＞－CH2－CH2－。
有机化合物极性强弱的大致判断。如葡萄糖，因分子中含有许多－OH，故为极性化合物。如氨基酸，因分子中既有正电基团，又有负电基团，故极性很强。高级脂肪酸如硬脂酸C17H35COOH，虽含有羟基这样的强极性官能团，但分子的主体由长链烃基组成，故极性依然很弱。
