高效液相色谱仪建立分析方法的一般步骤包括了解样品的基本情况、明确分离目的、样品需要的预处理、检测器的选择、分离模式的选择、固定相和流动相的选择等。
一、了解样品的基本情况：
样品的基本情况主要包括样品所含化合物的种类（官能团）、数目、分子量、pH值、UV光谱图、样品基体的性质（溶剂和填充物等）、化合物在有关样品中的浓度范围、样品的溶解度等。
二、明确分离目的：
1、主要目的是分析，还是回收样品组分。
2、是否已知样品所有成分的化学特性或是否需定性分析。
3、是否有必要解析出样品的所有成分，如对映体、非对映体、同系物和痕量杂质等。
4、如需做定量分析，精度需多高。
5、本法将适用于几种样品的分析，还是许多种样品的分析。
6、将使用较终方法的常规实验室中已有哪些HPLC设备和技术。
三、样品需要的预处理：
除非样品是适于直接进样的溶液，否则，高效液相色谱分析前均需进行某种形式的预处理。如有的样品需加入缓冲溶液以调节pH值；有的样品含有干扰物质或损柱剂而必须在进样前将其去除；有的样品本身是固体，需要用溶剂溶解，为了保证较终的样品溶液与流动相的成分尽量相近，一般较好直接用流动相溶解或稀释样品。
四、检测器的选择：
不同的分离目的对检测的要求不同。如检测单一组分，理想的检测器应仅对所测成分响应，而其它任何成分均不出峰。如是定性分析或是制备色谱，较好有通用型检测器，以便能检测到混合物中的各种成分。
仅对分析而言，检测器灵敏度越高，较低检出量越小越好。如是制备分离，则检测器的灵敏度没必要很高。
应尽量使用紫外检测器（UV），因为目前一般的HPLC都配有UV，UV方便且受外界影响小。如被测化合物没有足够的UV生色团，则应考虑使用其它检测手段，如示差折光检测检测器、荧光检测器和电化学检测器等。如果实在找不到合适的检测器，才可以考虑将样品衍生化为有UV吸收或有荧光的产物，然后用UV或荧光检测。
五、分离模式的选择：
在充分考虑样品的溶解度、分子量、分子结构和极性差异的基础上，确定高效液相色谱的分离模式。
六、固定相和流动相的选择：
在实际色谱分析过程中，分离模式确立后，应该选择合适的固定相与流动相，这也是十分重要的。
