高效液相色谱仪梯度洗脱（溶剂程序）是通过改变流动相组成来调整组分k值，改变分离因子α值，以达到在较短时间内实现较优分离的目的。
一、对色谱泵的要求：
色谱泵在任何情况下都要保持高精度。
1、流速要稳定平滑，重现性好。
2、溶剂混合要可靠充分：
（1）有效、重现的自动溶剂混合。
（2）有效、重现的梯度形成。
3、有效的流速范围：
制备柱和微柱色谱更为关注。
4、滞后体积：
仅应用于梯度实验。
二、梯度洗脱的主要条件：
1、A流动相－弱溶剂组成。
2、B流动相－强溶剂组成。
3、梯度洗脱时间。
4、线性、凸型和凹型等梯度曲线。
三、梯度洗脱的特点：
1、可改善分离，加快分析速度。
2、可改善峰形，减少拖尾，有利于痕量组分的分析。
3、可增加峰容量。
4、强烈滞留的组分不容易残留在柱上，可保持柱性能长期良好。
5、下次分析时，流动相需要平衡一段时间。不同溶剂的紫外吸收程度稍有差异，可能会引起基线漂移。
四、梯度滞后体积的影响：
1、滞后体积太大会使梯度变化延迟。
（1）如滞后体积为2mL，流速为1mL/min，实际梯度比设置值晚2min响应，可以接受。
（2）对微柱色谱影响更大，如滞后体积为2mL，流速为0.1mL/min，实际梯度比设置值晚20min响应，不能接受。
2、滞后体积不同使方法转换麻烦：
（1）滞后体积比文献值大或小都会使方法不能重现。
（2）滞后体积变化会导致梯度重现性不好。
3、普通分析型液相色谱的滞后体积为2～4mL。
4、设计不好的HPLC系统，滞后体积会随反压变化，使梯度的有效性不好，方法的适应性不好。
5、采用静态梯度混合器固定滞后体积，可明显改善梯度特性。
五、确定较优化梯度洗脱条件的步骤：
1、在全浓度范围内进行梯度洗脱，要确定待分离组分在梯度变化范围内可以被洗脱，初步观察组分的位置。
2、确定梯度使用范围和ΔΦ大小。Φ为强溶剂在洗脱液中所占的体积百分数。
3、选择几个梯度洗脱时间，确定S值。S是与强溶剂和样品有关的参数，对于RPLC分离小分子，S值一般为3～5。
4、确定梯度洗脱时间下的较优值（梯度洗脱时间小，流速大）。
5、可以进行非线性梯度洗脱，使待分离组分与其它物质尽可能分开。
6、若分离效果不好，可以调整pH值、盐类型和有机溶剂组成等，使组分峰与其它峰尽可能分开。
六、梯度洗脱操作注意事项：
1、两个流动相溶剂要能互溶，即极性不要相差太大。
2、吸附色谱只能是在小范围内变化，因此吸附色谱很少用梯度洗脱。
3、示差折光检测器不适应梯度洗脱。
七、程序升温在HPLC中没有受到青睐的原因：
在HPLC中，较低温度和较高温度受流动相粘度和沸点的限制，同时温度效应比较小。
