化学键合相色谱仪C18色谱柱填料的粒径、孔径、孔体积、键合反应、含碳量和端基封尾等对色谱行为有重要影响。
一、粒径：
粒径是指柱填料的颗粒直径大小。实际上色谱柱上所标的粒径是颗粒粒径的平均值。
一般来说，平均粒径越小，颗粒分布度越小，柱效越高。反之越低。
目前C18柱填料粒径在4～10um之间。
二、孔径：
孔径是指柱填料颗粒间的孔间隙。一般所说的孔径是填料的平均孔径。
无定形填料的平均孔径分布较宽，柱床结构不均匀，流动相速度不均匀，谱带展宽。
球形填料的平均孔径分布比较窄，柱床结构均匀，柱效高，重现性好。
平均孔径的大小对大分子化合物的分离影响较大。在用反相色谱分离如蛋白和多肽样品时，应选用大孔径（如30nm）的反相柱填料。
三、孔体积：
在分离较大分子化合物时，应选用较大孔体积的反相柱填料。
四、键合反应：
C18柱是以硅烷化键合型（Si－O－Si－C）存在的，这类键合反应目前应用较为普遍。
可以键合极性较大的有机基团，采用极性较小的溶剂作流动相。
可以键合极性较小的有机基团，采用极性较大的溶剂作流动相。
五、含碳量：
碳含量是指填料中的含碳量。
传统的测量技术是将填料加热到碳氢键断裂，然后通过测定损失的重量或形成的二氧化碳来计算含碳量。
键合相的色谱行为与键合密度、填料的密度和填料的表面积有关。通过增加键合密度或碳键长度，可增加含碳量，增加柱子的保留值。填料的密度越高，填柱所需的硅胶量越多，柱子的含碳量也越高。如果用两种不同密度和相同含碳量的填料填充柱子，其保留行为将明显不同。因此，单独以含碳量来预测色谱行为是不够的。
六、端基封尾：
端基封尾是用氯化三甲基硅烷等试剂与键合相表面的残留硅醇基反应，将残留硅醇基封锁起来的化学处理过程。
1、原因：
残余的硅醇基会对键合相的分离性能产生影响，特别是在非极性键合相的情况下，硅醇基的存在会降低硅胶表面的疏水性。对极性化合物或溶剂产生吸附，使键合相的分离性能改变。
2、方法：
为了进一步消除残留的游离硅醇基，一般在键合反应后再用封尾剂钝化，也可用十八烷基三氯硅烷再键合一次。
较常用的封尾剂有三甲基氯硅烷和六甲基乙硅氧烷。
3、作用：
（1）经封尾处理的硅胶基质固定相减小了溶质与固定相之间的次级相互作用，使分离有效改善。
（2）可改善对极性化合物的吸附或拖尾。
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