影响反相离子对色谱仪色谱保留的因素有流动相pH值、离子对试剂种类、离子对试剂浓度、有机溶剂性质、有机溶剂浓度、缓冲盐浓度和柱温等。
一、流动相pH值：
反相离子对色谱常用的流动相是甲醇－水、乙腈－水，流动相中一般含有3～10mol/L的离子对试剂。
流动相pH值决定离子化合物的解离度，合适的pH值是反相离子对色谱的重要条件。为了使化合物较大程度的解离，获得合适的保留和响应，又不超出硅胶基质色谱柱的承受范围，一般流动相pH = 2～7.5。
强酸性样品在低pH值能充分解离，对流动相pH值要求不严。对于弱酸性样品需在高pH值时才能充分解离，若pH值过低，则抑制解离，样品组分呈不解离溶质，故这些样品不太适合采用pH值分析。
碱性样品的分析可控制在较低pH值，能在色谱柱适应的范围内较方便的进行反相离子对色谱分析。
二、离子对试剂种类：
离子对试剂种类决定于被测样品的性质，通常选用与被测样品电荷相反的离子对试剂。
1、常用离子对试剂和主要应用对象。
（1）离子对试剂：烷基磺酸盐，如庚烷磺酸盐和樟脑磺酸盐等。
主要应用对象：强碱、弱碱、儿茶酚铵和肽类。
（2）离子对试剂：烷基磺酸盐，如辛基和十二烷基磺酸盐等。
主要应用对象：强碱、弱碱、儿茶酚铵和肽类。
（3）离子对试剂：季铵盐，如四丁溴化铵和十六烷基三甲铵等。
主要应用对象：强酸、弱碱及其盐类。
（4）离子对试剂：叔胺，如三辛铵。
主要应用对象：磺酸盐和羧酸。
（5）离子对试剂：高氯酸。
主要应用对象：胺。
2、不同种类的离子对试剂所形成的离子对在固定相上的保留不同。
对于同一类离子对试剂，其碳链长度不同，疏水性不同。离子对试剂的碳链越长，所形成的离子对越易在固定相上保留。反之，碳链越短，离子对的保留值越小。
（1）同一类离子对试剂中，亲水性基团（如－OH、－COOH和－NH2）数目越多，形成的离子对的保留值越小；疏水性基团（如芳基）数目越多，形成的离子对的保留值越大。
（2）烷基胺（铵）类离子对试剂所形成的离子对的保留顺序大致为季铵离子＜伯胺离子＜仲胺离子＜叔胺离子。
（3）不同无机阴离子的同一类离子对试剂所形成的离子对的保留顺序为Clˉ＜Brˉ＜Iˉ＜ClO4ˉ。
三、离子对试剂浓度：
当流动相中离子对试剂浓度增加，被固定相吸附的离子对试剂浓度增加，直至固定相上的离子对试剂饱和。由于样品保留主要取决于吸附在固定相上的反离子浓度，因此，随着流动相中离子对试剂的逐步增加，样品保留也逐步增加到极大值，若继续增加离子对试剂浓度，样品保留不但不增加，反而会减少。这是因为离子对试剂的反离子，如四丁基氯化铵（TBA+Clˉ）中Clˉ与样品离子（COOˉ）竞争保留在（TBA+）上。故一般流动相中的离子对试剂浓度为3～10mol/L。
四、有机溶剂性质：
有机溶剂种类可能改变选择性，但同时要考虑到离子对试剂的溶解度。多数季铵盐和磺酸盐可溶于甲醇，在乙腈中的溶解度较小，若增加乙腈中的含水量（约10%～20%），溶解度会增加。十二烷基硫酸钠在乙腈中的溶解度大于在甲醇中的溶解度。
五、有机溶剂浓度：
流动相中有机溶剂的比例增加，吸附在固定相上的离子对试剂减少，可选择性的降低离子型化合物的保留。有机溶剂的比例越高，k值越小。被测组分的疏水性和离子对试剂的疏水性越强，所需有机改性试剂的浓度越高。一般调节有机溶剂的比例使化合物的保留在0.5＜k＜20。
六、缓冲盐浓度：
流动相中缓冲盐的浓度增加，样品保留下降。
七、柱温：
在进行反相离子对色谱分析时，应特别注意色谱系统的恒温条件，以保证分离的重现性。
