高效气相色谱仪测定人血浆中硝酸异山梨酯浓度的色谱条件：
1、仪器：高效气相色谱仪
2、检测器：ECD
3、色谱柱：石英毛细管柱OV-101（25m×0.25mm I.D.，膜厚0.22um Shimadzu）
4、载气：高纯氮气
5、载气流速：1.25mL/min
6、分流比：1：80
7、尾吹气流速：20mL/min
8、进样口温度：200℃
9、检测器温度：250℃
10、程序升温：起始柱温150℃，保持9min，以40℃/min的速率升至200℃，保持7mim。
一、血浆样品的提取：
精密量取样品血浆1mL，加入内标溶液40uL，涡旋处理10s，加乙酸乙酯5mL，涡旋处提取3min，离心（3500rpm）10min，取有机相4.5mL，于50℃水浴上用氮气流吹干，残渣加乙酸乙酯50uL溶解后，精取2uL进样。
二、检测器的选择：
1、硝酸异山梨酯气雾剂给药后血药浓度很低，较高血药浓度在10ng/mL以下，较低定量限至少应达到0.1ng/mL，FID检测器无法满足测定要求。
2、硝酸异山梨酯的结构中含有两个硝酸酯基，硝酸酯基具有限强的亲电性，捕获电子的能力很强，因此在ECD上具有很高的响应。
3、ECD为痕量分析检测器，对亲电性物质的检测响应很高，可以达到纳克级水平，故人血浆中硝酸异山梨酯的浓度测定采用ECD。
4、载气和尾吹气的流速：ECD应使用高纯度的氮气，并需经脱氧脱气、分子筛脱水。载气流速主要从组分分离要求确定，尾吹气根据目标峰的峰形、峰面积或峰高和基线来确定。可通过实验确定。
三、色谱柱类型的选择：
1、硝酸异山梨酯气雾剂给药后血药浓度很低，较高血药浓度在10ng/mL以下，要求方法有很高的灵敏度。
2、血浆样品较为复杂，干扰物多，要求有很高的分离效果。
3、毛细管柱柱效远远高于填充柱，出峰尖锐，灵敏度高，因此痕量分析中优于填充柱。毛细管柱分离效果远远高于填充柱。故人血浆中硝酸异山梨酯的浓度测定选用毛细管柱。
4、固定相的选择：检测器为ECD，尽量不要选择含多卤原子的固定相，如甲基三氟丙基聚氧烷（QF-1、OV-210）和聚三氟氯乙烯蜡等。本实验选择了实验室常用的OV-101石英毛细管柱。
5、毛细管柱的柱管选择：兼顾柱效和样品容量，选择常规毛细管柱为柱长25m、内径0.25mm和膜厚0.22um的石英毛细管柱。
四、内标的选择：
1、体内药物分析中生物样品的处理很复杂，每一步都有可能导致样品的损失，为校正误差，需在样品处理前加入内标物，一般选择内标法。
2、内标物的选择：本实验选择3，5-二硝基氯苯。
（1）内标物与目标成分的脂溶性、挥发性、在OV-101固定液上色谱保留相似。
（2）3，5-二硝基氯苯含有二个硝基，与硝酸异山梨酯一样在ECD上有很高的响应。
五、柱温的选择：
程序升温：起始柱温150℃，保持9min，以40℃/min的速率升至200℃，保持7min。
1、选择程序升温：硝酸异山梨酯与内标物3，5-二硝基氯苯在起始柱温150℃，保持9min内已出峰，恒温条件可达完整分离，实验显示，样品在目标峰与内标物峰之后仍有血浆中其它物质峰，因此后续升温只是为了洗脱出血浆中其它物质，以便下一次进样分析。
2、程序升温方式的选择：恒温-线性升温-恒温。
理由：起始柱温150℃，保持9min，使硝酸异山梨酯与3，5-二硝基氯苯在该温度下获得完整分离，然后以仪器允许设置的较大升温速率（40℃/min）将柱温升至200℃并保持7min以洗脱本次进样带入的色谱保留较大其它物质，为下一次进样分析做准备。
六、进样口温度（气化室温度）与检测器温度的选择：
进样口温度200℃，检测器温度250℃。
1、进样口温度：200℃以上时硝酸异山梨酯破坏较多，200℃以下时硝酸异山梨酯气化不完整，故进样口温度设置为200℃。
2、检测器温度：一般检测器温度与进样口温度相同，但实验显示，250℃时ECD对硝酸异山梨酯的响应较大，本实验ECD温度设置为250℃。
3、较高柱温：为保护检测器，以防柱中流出物在检测器上凝结，污染检测器，检测器温度至少比柱温高30℃，即本实验柱温较高可设置到220℃，并减少维持时间。
